肺靶向AAV(干扰/过表达/敲除)

  腺相关病毒(AAV)作为基因转导和治疗载体,已被广泛使用于疾病基础研究和治疗方案开发。AAV在人体实验中的安全性也被证实。大量研究表明,肺靶向AAV可携带目的基因于目标部位表达,实现目标基因、蛋白的转导。同时,AAV能在肺组织中介导短发卡RNA(shRNA),实现RNA干扰。除此之外,还能利用分子生物学方法构建AAV-Cas9载体,实现目的基因敲除。

不同血清型AAV的肺部感染嗜性


  已对不同血清型AAV的天然肺嗜性进行了评估,结果显示肺靶向AAV嗜性根据动物模型的不同而存在差异。在高等灵长类动物模型肺部研究中,推荐AAV1型;在小鼠与低等灵长类动物模型中,推荐AAV5/AAV6型。
 
图1. 不同血清型在肺中载体表达情况[1]
注:以上数据仅供参考,具体结果以预实验为准
 

启动子选择

常用启动子:CMV[2]、CAG[3]
 

AAV在肺中注射方式

AAV拥有多种多样的感染肺部方式,下面以小鼠模型为例介绍几种常用的方法:

1.鼻内滴注

鼻内滴注法是一种直接的AAV感染法,操作简单且对设备要求低,对新手友好。但缺点是AAV颗粒容易沉积在上呼吸道(鼻道、鼻窦、咽)和胃肠道,如果需要有效地感染到下呼吸道,则可能需要更大剂量的AAV才能实现。


2.内镜辅助口腔气管插管手术

内镜气管插管术能够将AAV直接灌入肺中,无外科手术风险,且避免了上呼吸道的病毒颗粒损失。由于几乎所有AAV病毒颗粒都会到达肺内,所以要严格控制AAV的使用量。同时,与鼻内滴注法相比,口腔气管插管术需要一些特殊设备,操作起来也稍有难度。


3.气管内注射

与鼻内滴注相比,气管内注射能够提高AAV进入肺部的效率;而与口腔气管插管法相比,设备更简单,操作更容易。但是,气管内注射具有极高的外科手术风险,包括出血、切口开裂、感染以及较长的恢复期等。不仅如此,由于小鼠气管窄小,也很容易出现失误,将AAV注射到气管周围组织或食管中去。


4.其他
其他注射方式还包括静脉注射和瘤内注射,其中静脉注射还可分为肺静脉注射、尾静脉注射和颈静脉注射。
 

实例展示

AAV介导的CRISPR-Cas9系统实现对小鼠基因组编辑和癌症建模
载体:AAV9-KPL(sgKras-sgP53-sgLkb1);
实验动物:Cre依赖Cas9小鼠
注射方式和剂量:鼻腔和气管注射。每只小鼠注入病毒总量1x1011 GCs. Vol: 鼻腔 50ul,气管70ul;
启动子:U6,EFS;
实验方法和结果:通过将携带肺靶向作用及调控元件的AAV病毒(AAV9-KPL和AAV9-sgLacZ)导入小鼠体内,实现对肺腺癌常见易感基因(p53、Lkb1)功能缺失或突变,导致腺癌病理中产生肉眼可见的肿瘤。注射后3周、肺部μCT成像。
图2. 病毒介导的调控元件诱导肺部肿瘤的形成[4]
 
参考文献:
[1]
Carmela Zincarelli, Molecular Therapy, 2008
[2]Meyer-Berg H et al. Stem Cell Research & Therapy, 2020
[3]Kurosaki F et al. Gene therapy, 2017
[4]Randall J. Platt, Cell, 2014

 

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